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    Association of high-fat diet with neuroinflammation, anxiety-like defensive behavioral responses, and altered thermoregulatory responses in male rats.
    (2019) Noronha, Sylvana Izaura Salyba Rendeiro de; Lima, Paulo Marcelo de; Campos, Glenda Siqueira Viggiano; Chírico, Máira Tereza Talma; Abreu, Aline Rezende Ribeiro de; Figueiredo, Amanda Braga de; Silva, Fernanda Cacilda dos Santos; Chianca Júnior, Deoclécio Alves; Lowry, Christopher; Menezes, Rodrigo Cunha Alvim de
    Overweight and obesity are a worldwide pandemic affecting billions of people. These conditions have been associated with a chronic low-grade inflammatory state that is recognized as a risk factor for a range of somatic diseases as well as neurodevelopmental disorders, anxiety disorders, trauma- and stressor-related disorders, and affective disorders. We previously reported that the ingestion of a high-fat diet (HFD; 45% fat kcal/g) for nine weeks was capable of inducing obesity in rats in association with increased reactivity to stress and increased anxiety-related defensive behavior. In this study, we conducted a nine-week diet protocol to induce obesity in rats, followed by investigation of anxiety-related defensive behavioral responses using the elevated T-maze (ETM), numbers of FOS-immunoreactive cells after exposure of rats to the avoidance or escape task of the ETM, and neuroinflammatory cytokine expression in hypothalamic and amygdaloid nuclei. In addition, we investigated stress-induced cutaneous thermoregulatory responses during exposure to an open-field (OF). Here we demonstrated that nine weeks of HFD intake induced obesity, in association with increased abdominal fat pad weight, increased anxiety-related defensive behavioral responses, and increased proinflammatory cytokines in hypothalamic and amygdaloid nuclei. In addition, HFD exposure altered avoidance- or escape task-induced FOSimmunoreactivity within brain structures involved in control of neuroendocrine, autonomic, and behavioral responses to aversive stimuli, including the basolateral amygdala (BLA) and dorsomedial (DMH), paraventricular (PVN) and ventromedial (VMH) hypothalamic nuclei. Furthermore, rats exposed to HFD, relative to control dietfed rats, responded with increased tail skin temperature at baseline and throughout exposure to an open-field apparatus. These data are consistent with the hypothesis that HFD induces neuroinflammation, alters excitability of brain nuclei controlling neuroendocrine, autonomic, and behavioral responses to stressful stimuli, and enhances stress reactivity and anxiety-like defensive behavioral responses.
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    Ecto-nucleotidase activities of promastigotes from leishmania (Viannia) braziliensis relates to parasite infectivity and disease clinical outcome.
    (2012) Leite, Pauline Martins; Gomes, Rodrigo Saar; Figueiredo, Amanda Braga de; Serafim, Tiago Donatelli; Tafuri, Wagner Luiz; Gomes, Carolina Cavaliéri; Moura, Sandra Aparecida Lima de; Fietto, Juliana Lopes Rangel; Melo, Maria Norma; Dias, Fátima Ribeiro; Oliveira, Milton Adriano Pelli de; Rabello, Ana Lúcia Teles; Afonso, Luís Carlos Crocco
    Background: Leishmania (Viannia) braziliensis has been associated with a broad range of clinical manifestations ranging from a simple cutaneous ulcer to destructive mucosal lesions. Factors leading to this diversity of clinical presentations are not clear, but parasite factors have lately been recognized as important in determining disease progression. Given the fact that the activity of ecto-nucleotidases correlates with parasitism and the development of infection, we evaluated the activity of these enzymes in promastigotes from 23 L. braziliensis isolates as a possible parasite-related factor that could influence the clinical outcome of the disease. Methodology/Principal Findings: Our results show that the isolates differ in their ability to hydrolyze adenine nucleotides. Furthermore, we observed a positive correlation between the time for peak of lesion development in C57BL/6J mice and enzymatic activity and clinical manifestation of the isolate. In addition, we found that L. (V.) braziliensis isolates obtained from mucosal lesions hydrolyze higher amounts of adenine nucleotides than isolates obtained from skin lesions. One isolate with high (PPS6m) and another with low (SSF) ecto-nucleotidase activity were chosen for further studies. Mice inoculated with PPS6m show delayed lesion development and present larger parasite loads than animals inoculated with the SSF isolate. In addition, PPS6m modulates the host immune response by inhibiting dendritic cell activation and NO production by activated J774 macrophages. Finally, we observed that the amastigote forms from PPS6m and SSF isolates present low enzymatic activity that does not interfere with NO production and parasite survival in macrophages. Conclusions/Significance: Our data suggest that ecto-nucleotidases present on the promastigote forms of the parasite may interfere with the establishment of the immune response with consequent impaired ability to control parasite dissemination and this may be an important factor in determining the clinical outcome of leishmaniasis.
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    Extracellular nucleotide metabolism in Leishmania : influence of adenosine in the establishment of infection.
    (2008) Silva, Eduardo de Almeida Marques da; Oliveira, Jamile Camargos de; Figueiredo, Amanda Braga de; Lima Júnior, Djalma de Souza; Carneiro, Cláudia Martins; Fietto, Juliana Lopes Rangel; Afonso, Luís Carlos Crocco
    Leishmaniasis is a parasitic disease with a variety of clinical forms, which are related to the Leishmania species involved. In the murine model, Leishmania amazonensis causes chronic non-healing lesions in Leishmania braziliensis- or Leishmania major-resistant mouse strains. In this study, we investigated the involvement of the pathway of extracellular nucleotide hydrolysis, with special focus on the role of extracellular adenosine, in the establishment of Leishmania infection. Our results show that the more virulent parasitedL. Amazonensisdhydrolyzes higher amounts of ATP, ADP and AMP than the two other species, probably due to the higher expression of membrane NTPDase. Corroborating the idea that increased production of adenosine is important to lesion development and establishment of tissue parasitism, we observed that increased 50-nucleotidase activity in L. braziliensis or addition of adenosine at the moment of infection with this parasite resulted in an increase in lesion size and parasitism as well as a delay in lesion healing. Furthermore, inhibition of adenosine receptor A2B led to decreased lesion size and parasitism. Thus, our results suggest that the conversion of ATP, a molecule with pro-inflammatory activity, into adenosine, which possesses immunomodulatory properties, may contribute to the establishment of infection by Leishmania.
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    Leishmania amazonensis impairs DC function by inhibiting CD40 expression via A2B adenosine receptor activation.
    (2012) Figueiredo, Amanda Braga de; Serafim, Tiago Donatelli; Silva, Eduardo de Almeida Marques da; Fernandes, José Roberto Meyer; Afonso, Luís Carlos Crocco
    Dendritic cells (DCs) play an essential role in the modulation of immune responses and several studies have evaluated the interactions between Leishmania parasites and DCs. While extracellular ATP exhibits proinflammatory properties, adenosine is an important anti-inflammatory mediator. Here we investigated the effects of Leishmania infection on DC responses and the participation of purinergic signalling in this process. Bone marrowderived dendritic cells (BMDCs) from C57BL/6J mice infected with Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis or Leishmania major metacyclic promastigotes showed decreased major histocompatibility complex (MHC) class II and CD86 expression and increased ectonucleotidase expression as compared with uninfected cells. In addition, L. amazonensis-infected DCs, which had lower CD40 expression, exhibited a decreased ability to induce T-cell proliferation. The presence of MRS1754, a highly selective A2B adenosine receptor antagonist at the time of infection increased MHC class II, CD86 and CD40 expression in L. amazonensis-infected DCs and restored the ability of the infected DCs to induce T-cell proliferation. Similar results were obtained through the inhibition of extracellular ATP hydrolysis using suramin. In conclusion, we propose that A2B receptor activation may be used by L. amazonensis to inhibit DC function and evade the immune response.
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    Leishmania amazonensis prejudica resposta de células dendríticas via inibição da expressão de CD40 mediada por ectonucleotidases e pela ativação do receptor de adenosina A2B.
    (Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2012) Figueiredo, Amanda Braga de; Afonso, Luís Carlos Crocco
    Infecções por Leishmania podem resultar num amplo espectro de manifestações clínicas, e o resultado da doença é determinado pela espécie do parasito e a resposta imune do hospedeiro. Células dendríticas desempenham um papel essencial na modulação da resposta imune, incluindo durante a infecção por Leishmania. O ATP extracelular exibe propriedades pró-inflamatórias, enquanto a adenosina é um importante mediador antiinflamatório. Baseados nessas observações, nosso objetivo foi investigar os efeitos da infecção por Leishmania na resposta de células dendríticas e a participação da sinalização purinérgica nesse processo. Células dendríticas derivadas de medula óssea de camundongos C57BL/6J foram infectadas com promastigotas metacíclicas de L. amazonensis, L. braziliensis ou L. major marcadas com CFSE (numa proporção de 3 parasitos por célula dendrítica). Células infectadas reduziram a expressão de MHCII e CD86, independentemente da espécie de parasito utilizada. A expressão de CD40 foi significativamente maior em células dendríticas infectadas com L. braziliensis ou L. major, quando comparadas a células dendríticas não infectadas. Por outro lado, a expressão de CD40 não foi alterada em células dendríticas infectadas com L. amazonensis, e estas células apresentaram uma capacidade reduzida de induzir a proliferação de linfócitos T, durante a reação mista de leucócitos e o ensaio de proliferação antígeno-específica. Para tentar descrever os mecanismos envolvidos nesses processos, inicialmente analisamos a produção de IL-10 em sobrenadantes de cultura por ELISA e não encontramos diferenças entre culturas controles e culturas de células dendríticas infectadas. O bloqueio do receptor de IL-10 pelo anticorpo 1B1.3a restaurou parcialmente a expressão de MHCII e CD86 em células dendríticas infectadas com L. braziliensis ou L. major, mas não em células dendríticas infectadas com L. amazonensis. A co-expressão das ectonucleotidases CD39 e CD73 e a atividade enzimática destas enzimas foram significativamente aumentadas em células infectadas e a inibição da hidrólise do ATP extracelular por suramina aumentou a expressão de MHCII e CD86 nestas células, independentemente da espécie de parasito utilizada. Curiosamente, a presença de MRS1754, um antagonista altamente seletivo do receptor de adenosina A2B, no momento da infecção, aumentou a expressão de MHCII, CD86 e CD40 somente em células dendríticas infectadas com L. amazonensis, células com expressão diferenciada desse receptor, e recuperou a capacidade de células dendríticas de induzirem a proliferação de linfócitos T. Concluindo, diferentes espécies de Leishmania utilizam mecanismos diferentes para evadir a resposta imune, e propomos que a atividade ectonucleotidásica e a ativação do receptor A2B de células dendríticas podem ser utilizadas por L. amazonensis para esse fim.
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    Leishmania amazonensis-induced caMP triggered by adenosine a2B receptor is important to inhibit dendritic cell activation and evade immune response in infected mice.
    (2017) Figueiredo, Amanda Braga de; Testasicca, Miriam Conceição de Souza; Mineo, Tiago Wilson Patriarca; Afonso, Luís Carlos Crocco
    Differently from others Leishmania species, infection by the protozoan parasite L. amazonensis is associated with a lack of antigen-specific T-cell responses. Dendritic cells (DC) are essential for the innate immune response and for directing the differentiation of T-helper lymphocytes. Previously, we showed that L. amazonensis infection impairs DC activation through the activation of adenosine A2B receptor, and here, we evaluated the intracellular events triggered by this receptor in infected cells. To this aim, bone marrow-derived DC from C57BL/6J mice were infected with metacyclic promastigotes of L. amazonensis. Our results show, for the first time, that L. amazonensis increases the production of cAMP and the phosphorylation of extracellular signal-regulated protein kinases 1/2 (ERK1/2) in infected DC by a mechanism dependent on the A2B receptor. Furthermore, L. amazonensis impairs CD40 expression and IL-12 production by DC, and the inhibition of adenylate cyclase, phosphoinositide 3-kinase (PI3K), and ERK1/2 prevent these effects. The increase of ERK1/2 phosphorylation and the inhibition of DC activation by L. amazonensis are independent of protein kinase A (PKA). In addition, C57BL/6J mice were inoculated in the ears with metacyclic promastigotes, in the presence of PSB1115, an A2B receptor antagonist. PSB1115 treatment increases the percentage of CD40+ DC on ears and draining lymph nodes. Furthermore, this treatment reduces lesion size and tissue parasitism. Lymph node cells from treated mice produce higher levels of IFN-γ than control mice, without altering the production of IL-10. In conclusion, we suggest a new pathway used by the parasite (A2B receptor → cAMP → PI3K → ERK1/2) to suppress DC activation, which may contribute to the decrease of IFN-γ production following by the deficiency in immune response characteristic of L. amazonensis infection.
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    Leishmania metacyclogenesis is promoted in the absence of purines.
    (2012) Serafim, Tiago Donatelli; Figueiredo, Amanda Braga de; Costa, Pedro Augusto Carvalho; Silva, Eduardo de Almeida Marques da; Gonçalves, Ricardo; Moura, Sandra Aparecida Lima de; Gontijo, Nelder de Figueiredo; Silva, Sydnei Magno da; Michalick, Marilene Susan Marques; Fernandes, José Roberto Meyer; Carvalho, Roberto Paes de; Uliana, Silvia Reni Bortolin; Fietto, Juliana Lopes Rangel; Afonso, Luís Carlos Crocco
    Leishmania parasites, the causative agent of leishmaniasis, are transmitted through the bite of an infected sand fly. Leishmania parasites present two basic forms known as promastigote and amastigote which, respectively, parasitizes the vector and the mammalian hosts. Infection of the vertebrate host is dependent on the development, in the vector, of metacyclic promastigotes, however, little is known about the factors that trigger metacyclogenesis in Leishmania parasites. It has been generally stated that ‘‘stressful conditions’’ will lead to development of metacyclic forms, and with the exception of a few studies no detailed analysis of the molecular nature of the stress factor has been performed. Here we show that presence/absence of nucleosides, especially adenosine, controls metacyclogenesis both in vitro and in vivo. We found that addition of an adenosine-receptor antagonist to in vitro cultures of Leishmania amazonensis significantly increases metacyclogenesis, an effect that can be reversed by the presence of specific purine nucleosides or nucleobases. Furthermore, our results show that proliferation and metacyclogenesis are independently regulated and that addition of adenosine to culture medium is sufficient to recover proliferative characteristics for purified metacyclic promastigotes. More importantly, we show that metacyclogenesis was inhibited in sand flies infected with Leishmania infantum chagasi that were fed a mixture of sucrose and adenosine. Our results fill a gap in the life cycle of Leishmania parasites by demonstrating how metacyclogenesis, a key point in the propagation of the parasite to the mammalian host, can be controlled by the presence of specific purines.
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    O papel dos receptores de adenosina na resposta de células NK durante a infecção por Leishmania amazonensis.
    (2017) Oliveira, Ive Mendes; Afonso, Luís Carlos Crocco; Figueiredo, Amanda Braga de; Afonso, Luís Carlos Crocco; Carvalho, Andréa Teixeira de; Roatt, Bruno Mendes
    As células Natural Killer (NK) são importantes células efetoras na imunidade inata e participam ativamente da resposta imune do hospedeiro contra infecções, inclusive durante a infecção por Leishmania amazonensis. Células NK secretam IFN-γ após a estimulação por IL-12 produzida por macrófagos e células dendríticas (DC). Esta citocina é crucial para a eliminação de L. amazonensis por meio da ativação de fagócitos e para o desenvolvimento de respostas adaptativas subsequentes, especialmente do tipo Th1. O ATP liberado por células sob estresse, é capaz de auxiliar no estabelecimento de resposta inflamatória, enquanto a adenosina, produto da hidrólise de ATP por ecto-nucleotidases, leva as células a um estado anti-inflamatório. L. amazonensis expressa enzimas capazes de degradar ATP extracelular a adenosina, induzindo assim a resposta anti-inflamatória de várias células, incluindo macrófagos, DC e possivelmente células NK. O objetivo deste estudo foi avaliar o papel dos receptores de adenosina em células NK durante a infecção por L. amazonensis. Para isso, avaliamos a presença dos receptores A2a e A2b de adenosina na superfície da célula NK por microscopia de fluorescência, e observamos que estes receptores estão presentes na superfície da célula NK, e que há o aumento da expressão do receptor A2a na superfície celular quando a célula NK é cultivada na presença de L. amazonensis. Além disso, DC derivadas de medula óssea de camundongos C57BL/6 infectadas por L. amazonensis foram co-cultivadas com células NK recém-isoladas de baço, na presença de antagonistas dos receptores A2a e A2b, e a produção de IFN-γ foi medida por ELISA. Observamos que a inibição do receptor A2a leva ao aumento da produção de IFN-γ e a inibição de ambos os receptores leva à diminuição da taxa de infecção de DC presentes na co-cultura. Analisamos, por citometria de fluxo, a produção de IFN-γ e IL-10 por células NK, linfócitos T CD4 e linfócitos T CD8, em camundongos C57BL/6 infectados por L. amazonensis e tratados com antagonistas dos receptores A2a e A2b e dosamos por ELISA a produção de IFN-γ por células de linfonodos estimuladas com antígeno particulado de Leishmania amazonensis. Mostramos que a inibição do receptor A2a aumenta a porcentagem de células NK e linfócitos T CD4 produtoras de IFN-γ sem haver aumento da produção de IL-10, além de levar ao aumento da produção de IFN-γ por células de linfonodos estimuladas in vitro. Com estes resultados, podemos concluir que o receptor de adenosina A2a, presente na célula NK, tem um papel de grande importância na infecção por L. amazonensis e seu bloqueio leva ao aumento da produção de citocinas pró-inflamatórias durante a infecção, tanto em modelo in vitro, quanto in vivo.
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    Purinergic signaling and infection by Leishmania : a new approach to evasion of the immune response.
    (2016) Figueiredo, Amanda Braga de; Testasicca, Miriam Conceição de Souza; Afonso, Luís Carlos Crocco
    Infection by protozoan parasites is part of the most common Tropical Neglected Diseases. In the case of leishmaniasis, several millions of people are at risk of contracting the disease. In spite of innumerous studies that elucidated the immune response capable of killing the parasite, the understanding of the evasion mechanisms utilized by the parasite to survive within the very cell responsible for its destruction is still incomplete. In this review, we offer a new approach to the control of the immune response against the parasite. The ability of the parasite to modulate the levels of extracellular ATP and adenosine either by directly acting on the levels of these molecules or by inducing the expression of CD39 and CD73 on the infected cell may influence the magnitude of the immune response against the parasite contributing to its growth and survival.
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    Recrutamento do receptor de adenosina A2B e ativação da via de AMPc- PI3K-ERK1/2 inibem a resposta de células dendríticas infectadas por Leishmania amazonensis.
    (2016) Figueiredo, Amanda Braga de; Afonso, Luís Carlos Crocco; Gonçalves, Teresa Maria Fonseca de Oliveira; Cunha, Rodrigo Pinto dos Santos Antunes da; Brandão, Rogélio Lopes; Oliveira, Milton Adriano Pelli de; Faria, Ana Maria Caetano de; Antonelli, Lis Ribeiro do Valle
    A infecção por Leishmania pode resultar num amplo espectro de manifestações clínicas e a infecção por Leishmania amazonensis é associada a uma deficiência na resposta de linfócitos T específicos para o parasito. Células dendríticas direcionam a diferenciação de linfócitos Th1 que contribuem para o controle da infecção por Leishmania. Em um trabalho anterior, nós mostramos que a infecção por L. amazonensis, mas não por L. braziliensis ou L. major, prejudica a resposta de células dendríticas por um mecanismo dependente do receptor de adenosina A2B. Neste trabalho, nós avaliamos a expressão de receptores de adenosina e os eventos intracelulares ativados a partir do receptor A2B em células dendríticas infectadas, bem como o papel desses eventos na infecção de camundongos por L. amazonensis. Inicialmente, células dendríticas derivadas de células de medula óssea de camundongos C57BL/6J foram infectadas por promastigotas metacíclicas de L. amazonensis, L. braziliensis ou L. major. Imagens obtidas por microscopia de fluorescência mostraram que a infecção por promastigotas metacíclicas de L. amazonensis estimula a redistribuição do receptor A2B para a superfície de células dendríticas infectadas, sem alterar a quantidade total do receptor, avaliada por western blotting, nem a expressão dos receptores de adenosina A1, A2A e A3. A infecção por L. braziliensis, L. major ou promastigotas procíclicas de L. amazonensis não alteram a expressão do receptor A2B em células infectadas. Nossos resultados mostraram, ainda, que a infecção por L. amazonensis estimula a produção de AMPc e a fosforilação de ERK1/2 por mecanismos dependentes do receptor A2B. Além disso, L. amazonensis prejudica a expressão de CD40 e a produção de IL-12p70 por células dendríticas, efeitos independentes de IL-10 e revertidos pela inibição de adenilato ciclase, de PI3K e da fosforilação de ERK1/2. Por fim, camundongos infectados na orelha por L. amazonensis na presença de inibidores do receptor A2B ou das proteínas PI3K ou ERK1/2 desenvolvem lesões menores se comparados a animais controles, mas apenas o bloqueio do receptor A2B é capaz de diminuir o parasitismo tecidual. Concluindo, nós propomos um novo mecanismo utilizado por L. amazonensis (redistribuição do receptor A2B AMPc PI3K ERK1/2) para inibir a ativação de células dendríticas, que parece ser importante para a deficiência na resposta imune observada na infecção por essa espécie de parasito.