Browsing by Author "Santos, Ramon de Freitas"

Now showing 1 - 3 of 3
  • No Thumbnail Available
    Item
    Caracterização e avaliação da atividade ectonucleotidásica do Trypanosoma cruzi e sua relação com a infectividade in vitro.
    (2008) Santos, Ramon de Freitas; Fietto, Juliana Lopes Rangel
    Neste trabalho foi avaliada a participação de ecto-nucleotidases, especialmente da família ENTPDase, na infecção in vitro pelo Trypanosoma cruzi. Foi demonstrado que diferentes cepas/clone apresentam atividade ecto-nucleotídásica diversa, porém, as formas tripomastigotas mantém maior hidrólise de ATP. Adicionalmente, utilizando a cepa Y, que apresentou a maior polaridade entre hidrólise de ATP e ADP, definimos uma cinética de atividade ecto-nucleotidásica sobre nucleotídeos de adenina durante a manutenção do ciclo celular (passagens) em células VERO. Nas passagens celulares as formas tripomastigotas apresentaram as maiores atividades ecto-ATPásicas e uma tendência à diminuição da relação de hidrólise ATP/ADP com o aumento do número de passagens. Na terceira passagem poucos parasitos foram capazes de internalizar, originando parasitos de P4, com perfil de hidrólise similar aos parasitos das passagens anteriores. A maioria dos parasitos que não internalizaram se diferenciaram em formas arredondadas do tipo amastigotas e apresentaram uma reduzida razão de hidrólise ATP/ADP, semelhante aos amastigotas derivados de tripomastigotas de P1 e P3. Estes dados sugerem que a diminuição da relação ATPase/ADPase seja um fator que de algum modo impede a internalização dos parasitos, induzindo à sua diferenciação e diminuição da infectividade. O uso dos inibidores de apirases como, Suramina, ARL67156 e GdCl3 levou ao bloqueio parcial da atividade ecto-ATPásica e ecto-ADPásica, nos parasitos vivos e na NTPDase-I recombinante purificada, e foram capazes de inibir a infecção em células VERO até o máximo de 78%. A infectividade in vitro também foi inibida pelo tratamento com antisoro anti-NTPDase-I, entretanto, este não se mostrou capaz de bloquear significativamente a hidrólise de ATP e ADP, sugerindo que esta proteína possa ter outras funções que afetam a infectividade além da regulação da concentração de nucleotídeos extracelulares, como, por exemplo, participação na adesão celular. Nossos dados, de maneira geral, indicam a participação das E-NTPDases e da NTPDase-I no processo infectivo e sugerem fortemente que o bloqueio da sinalização dependente destes parece ser realmente um bom alvo para a quimioterapia e possivelmente para imunização. Assim, a inibição do metabolismo extracelular de nucleotídeos de adenina surge agora efetivamente como um novo alvo para o bloqueio da infecção pelo T. cruzi.
  • No Thumbnail Available
    Item
    Influence of ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase activity on Trypanosoma cruzi infectivity and virulence.
    (2009) Santos, Ramon de Freitas; Pôssa, Marcela Auxiliadora Souza; Bastos, Matheus Silva e; Guedes, Paulo Marcos da Matta; Almeida, Márcia Rogéria de; DeMarco, Ricardo; Almeida, Sergio Verjovski; Bahia, Maria Terezinha; Fietto, Juliana Lopes Rangel
    Background: The protozoan Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease. There are no vaccines or effective treatment, especially in the chronic phase when most patients are diagnosed. There is a clear necessity to develop new drugs and strategies for the control and treatment of Chagas disease. Recent papers have suggested the ecto-nucleotidases (from CD39 family) from pathogenic agents as important virulence factors. In this study we evaluated the influence of Ecto- Nucleoside-Triphosphate-Diphosphohydrolase (Ecto-NTPDase) activity on infectivity and virulence of T. cruzi using both in vivo and in vitro models. Methodology/Principal Findings: We followed Ecto-NTPDase activities of Y strain infective forms (trypomastigotes) obtained during sequential sub-cultivation in mammalian cells. ATPase/ADPase activity ratios of cell-derived trypomastigotes decreased 3- to 6-fold and infectivity was substantially reduced during sequential sub-cultivation. Surprisingly, at third to fourth passages most of the cell-derived trypomastigotes could not penetrate mammalian cells and had differentiated into amastigote-like parasites that exhibited 3- to 4-fold lower levels of Ecto-NTPDase activities. To evidence the participation of T. cruzi Ecto-NTPDase1 in the infective process, we evaluated the effect of known Ecto- ATPDase inhibitors (ARL 67156, Gadolinium and Suramin), or anti-NTPDase-1 polyclonal antiserum on ATPase and ADPase hydrolytic activities in recombinant T. cruzi NTPDase-1 and in live trypomastigotes. All tests showed a partial inhibition of Ecto-ATPDase activities and a marked inhibition of trypomastigotes infectivity. Mice infections with Ecto-NTPDase-inhibited trypomastigotes produced lower levels of parasitemia and higher host survival than with non-inhibited control parasites. Conclusions/Significance: Our results suggest that Ecto-ATPDases act as facilitators of infection and virulence in vitro and in vivo and emerge as target candidates in chemotherapy of Chagas disease.
  • No Thumbnail Available
    Item
    Trypanosoma cruzi nucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 (TcNTPDase-1) biochemical characterization, immunolocalization and possible role in host cell adhesion.
    (2014) Moura, Christiane Mariotini; Bastos, Matheus Silva e; Castro, Felipe Freitas de; Trindade, Mellina Lanna; Vasconcellos, Raphael de Souza; Vale, Myriam Augusta Araújo Neves do; Moreira, Bernardo Pereira; Santos, Ramon de Freitas; Oliveira, Claudia Miranda de; Cunha, Luana Celina Seraphim; Souto, Xênia Macedo; Bressan, Gustavo Costa; Silva Júnior, Abelardo; Baqui, Munira Muhammad Abdel; Bahia, Maria Terezinha; Almeida, Márcia Rogéria de; Fernandes, José Roberto Meyer; Fietto, Juliana Lopes Rangel
    Previous work has suggested that Trypanosoma cruzi diphosphohydrolase 1 (TcNTPDase-1) may be involved in the infection of mammalian cells and serve as a potential target for rational drug design. In this work, we produced recombinant TcNTPDase-1 and evaluated its nucleotidase activity, cellular localiza- tion and role in parasite adhesion to mammalian host cells. TcNTPDase-1 was able to utilize a broad range of triphosphate and diphosphate nucleosides. The enzyme’s Km for ATP (0.096mM) suggested a capabil-ity to influence the host’s ATP-dependent purinergic signaling. The use of specific polyclonal antibodies allowed us to confirm the presence of TcNTPDase-1 at the surface of parasites by confocal and electron microscopy. In addition, electron microscopy revealed that TcNTPDase-1 was also found in the flagellum, flagellum insertion region, kinetoplast, nucleus and intracellular vesicles. The presence of this enzyme in the flagellum insertion region and vesicles suggests that it may have a role in nutrient acquisition, and the widespread distribution of TcNTPDase-1 within the parasite suggests that it may be involved in other biological process. Adhesion assays using anti-TcNTPDase-1 polyclonal antibodies as a blocker or purified recombinant TcNTPDase-1 as a competitor revealed that the enzyme has a role in parasite–host cell adhesion. These data open new frontiers to future studies on this specific parasite–host interaction and other unknown functions of TcNTPDase-1 related to its ubiquitous localization.