Estudos sobre consumo de glicerol por leveduras para fins biotecnológicos.
No Thumbnail Available
Date
2019
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Nos últimos anos o aumento do excedente de produção do glicerol bruto, um
subproduto da produção do biodiesel, tem estimulado a busca por processos
alternativos de aplicação do glicerol. De entre as alternativas, destacam-se os
processos biotecnológicos onde o glicerol é convertido por microrganismos em
um produto com maior valor agregado, de amplo uso industrial e com menor
impacto ambiental. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar
Wickerhamomyces anomalus LBCM1105, uma cepa capaz de utilizar
eficientemente o glicerol como única fonte de carbono, através do isolamento e
caracterização do transportador de alta afinidade de glicerol (WaStl1p), e do
sequenciamento do seu genoma. Estratégias de engenharia genética foram
também utilizadas em Saccharomyces cerevisiae BY4741, com intuito de
otimizar o consumo de glicerol e obter a sua conversão em etanol. LBCM1105
apresentou velocidades de crescimento maiores que BY4741 independente do
meio (YP ou YNB) e da fonte de carbono (glicose ou glicerol). Com o objetivo
de melhorar o desempenho de BY4741 em glicerol, foi tentada a
sobrexpressão simultânea do transportador ativo de glicerol Stl1 e da primeira
enzima da assimilação do glicerol, a glicerol quinase Gut1, com vista a
aumentar o fluxo metabólico de consumo do glicerol. Adicionalmente foi
também sobrexpresso o fator de transcrição/ativador Pdc2 que controla vários
genes, incluindo PDC1, PDC10 e THI10, com vista a promover o desvio do
fluxo glicolítico para a fermentação. Todas as construções foram confirmadas
por amplificação de fragmentos alvo e sequenciamento de DNA. O
desempenho final de cada mutante foi avaliado, não tendo sido obtido o efeito
esperado. A taxa de crescimento foi tanto menor quanto mais modificações
genéticas, sugerindo uma diminuição de fitness proporcional. Em colaboração
com o Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE), o
genoma da LBCM1105 foi sequenciado, montado, anotado e submetido a
análises filogenéticas multiloci. O genoma da W. anomalus LBCM1105
apresenta 12,78 Mb, com %CG de 34,52, cobertura de 20,5x em profundidade e 90% de extensão e completude. Comparando com leveduras conhecidas, o
genoma contém todas as sequências de proteínas relacionadas ao transporte e
metabolismo de glicerol. O gene WaSTL1 foi isolado por PCR e clonado no
vetor (pCev-G2-Km). O mutante S. cerevisiae BY4741 stl1Δ foi transformado
com a construção. A caracterização do mecanismo de transporte de glicerol
confirmou (i) que WaStl1p tem uma elevada afinidade para o glicerol, Km =
0,96 ± 0,15 mM, (ii) que a cepa LBCM1105 apresenta além da afinidade uma
elevada quantidade de transportador ativo, Vmax = 148,3 ± 10,16 μmol·h−1·g−1,
e (iii) que o gene expresso heterologamente em S. cerevisiae stl1Δ
complementa o mutante. O caráter ativo do transporte foi confirmado pela
sensibilidade ao protonionóforo carbonil cianeto m-clorofenilhidrazona, tanto na
LBCM1105 como na S. cerevisiae stl1Δ WaSTL1. Futuros estudos das vias
metabólicas de glicerol em leveduras serão necessários para que novas
estratégias de engenharia genética sejam mais eficientes.
Description
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
Keywords
Cachaça, Biodiesel, Etanol, Biotecnologia - indústria.
Citation
CUNHA, Aureliano Claret da. Estudos sobre consumo de glicerol por leveduras para fins biotecnológicos. 2019. 124 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia) - Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2018.