E-NTPDase-2 de Leishmania amazonensis é importante na adesão do parasito ao macrófago e participa da modulação da resposta inflamatória, de forma dependente e independente da atividade ectonucleotidás.
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Date
2015
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Abstract
As NTPDases (nucleosídeo trisfosfato difosfohidrolases) são enzimas com a
habilidade de hidrolisar nucleotídeos di e trifosfatados sob estímulo de íons bivalentes
(Ca2+ ou Mg2+). São encontradas em diversos tipos celulares, incluindo protozoários,
como parasitos do gênero Leishmania. Dada a relação entre a expressão e a atividade
de Ecto-NTPDase de L. amazonensis e a capacidade do parasito em causar lesão em
camundongos, decidimos investigar os mecanismos pelos quais essa enzima participa
da infecção em macrófagos, a principal célula hospedeira para Leishmania.
Primeiramente investigamos o papel da expressão dessa enzima na adesão à célula
hospedeira. Observamos que promastigotas metacílicas que possuem alta expressão
de E-NTPDase-2 aderem mais à células J774. A inibição da expressão dessa enzima
por cultivo em meio suplementado com adenina reduz a adesão e internalização dos
parasitos. Demonstramos, ainda, que o bloqueio da enzima por anticorpo antiNTPDase-2 de Leishmania resulta numa redução da adesão e internalização dos
parasitos. Em formas amastigotas, por outro lado, a atividade e expressão da enzima
é bastante reduzida e não parece ter nenhum efeito sob a infecção dessas formas.
Tendo comprovado o papel da E-NTPDase-2 na adesão e internalização de L.
amazonensis na célula hospedeira, objetivamos identificar o receptor de macrófagos
envolvido nesse processo. Resultados anteriores levantaram a hipótese que o CR3
estaria envolvido nessa ligação. O bloqueio desse receptor com anticorpo anti-CD11b
foi capaz de reduzir drasticamente a ligação e internalização de NTPDase
recombinante, como demonstrado por microscopia confocal. Decidimos ainda
investigar se a presença da enzima interfere com a sobrevivência do parasito em
macrófagos estimulados por IFN-e LPS. Observamos que parasitos de alta atividade
e expressão de E-NTPDase-2 sobrevivem mais em células ativadas, por reduzirem a
produção de NO por essas células. A inibição da atividade ectonucleotidásica dos
parasitos da cepa PH8, por incubação dos parasitos com DIDS, reduz a capacidade
de L. amazonensis de modular a produção de NO e sobreviver em macrófagos
estimulados. Além disso, a infecção por L. amazonensis reduz a produção de citocinas
inflamatórias TNF-α e IL-12. Essa modulação é revertida em parasitos tratados com
DIDS. Para investigar se a adenosina é responsável pela inibição da resposta
inflamatória, a infecção foi realizada na presença de antagonistas específicos dos
receptores de adenosina A2A ou A2B. O bloqueio dos receptores A2B reduziu a
sobrevivência do parasito no interior das células estimuladas. Isso está associado com
um aumento na produção de NO, IL-12 e TNF-α. Tomados em conjunto, estes
resultados mostram que a atividade de E-NTPDase-2 em L. amazonensis é importante
para a geração de substrato para a produção de adenosina que, ao atuar sobre os
receptores A2B, reduz a produção de IL-12 e TNF-α, citocinas que são essenciais para
a produção de NO pelas células estimuladas, favorecendo a infecção. Por fim, para
investigar se a enzima teria um papel direto na modulação da resposta imune,
tratamos macrófagos com rNTPDase de Leishmania por 3 horas. As células foram
lavadas e estimuladas por 48 horas na presença de IFN-e LPS. Observamos que
mesmo na ausência de atividade ectonucleotidásica, a enzima recombinante é capaz
de modular a produção de NO, IL-12 e TNF-α. A inibição da atividade por DIDS ou o
bloqueio dos receptores de adenosina não impede que a rNTPDase tenha um efeito
imunomodulador. Mais ainda, demonstramos que quando o CD11b das células foi
bloqueado por anticorpo específico, a rNTPDase perdeu a capacidade em modular a
resposta inflamatória. Em síntese, demonstramos que a E-NTPDase-2 de L.
amazonensis é importante na adesão do parasito à células hospedeira pela ligação
ao receptor CD11b e reduz a produção de NO e citocinas inflamatórias de maneira
dependente e independente da atividade ectonucleotidásica.
Description
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
Keywords
Leishmania brasiliensis, Citocinas, Macrófagos, Óxido nítrico
Citation
GOMES, Rodrigo Saar. E-NTPDase-2 de Leishmania amazonensis é importante na adesão do parasito ao macrófago e participa da modulação da resposta inflamatória, de forma dependente e independente da atividade ectonucleotidás. 2015. 165 f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2015.