PROPP - Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-graduação

Permanent URI for this community

https://monog.ufop.br/handle/123456789/416

Browse

Now showing 1 - 20 of 26

Adenosine production via CD39/CD73 pathway promotes Leishmania amazonensis survival in macrophages.
(2014) Bajracharya, Bijay; Afonso, Luís Carlos Crocco
A leishmaniose cutânea (CL), causada por L. amazonensis, é caracterizada por uma intensa imuno- supressão e multiplicação descontrolada do parasito em modelos experimentais e é geralmente grave em humanos, variando desde a forma cutânea até a cutâneo-difusa. Não existem mecanismos precisos conhecidos sobre como L. amazonensis modula a resposta imunológica para que os macrófagos (MФ) infectados com L. amazonensis se tornem refratários à ativação por células T efetoras. Aqui, nós investigamos o possível mecanismo regulador que Leishmania provavelmente pode induzir em MФ residentes durante a interação precoce, de modo a impedir ativação das células. Neste estudo, analisou-se a expressão de CD39 e CD73, por citometria de fluxo, em MФ peritoneais murinos infectados com promastigotas metacíclicas de L. amazonensis e também a porcentagem dessas células que expressam a CD39 e CD73 foi avaliada. Nossos resultados mostraram que em 72hrs inativos os MФ tiveram baixa expressão de CD73. Curiosamente, no entanto, ao contrário de MФ tratados com LPS os infectados com L. amazonensis expressaram altos níveis de CD73. Esta informação foi posteriormente validada pelos resultados de estudos no contexto ex-vivo que mostrou igualmente que MФ infectados são predominantemente CD73+. Quando as atividades enzimáticas de CD39 e CD73 foram bloqueadas, tal como pelo uso de DIDS e MAD αβ, tanto a infecção quanto o número de amastigotas diminuiu significativamente após 48 horas de incubação. Da mesma forma, a inibição dos receptores de adenosina A2a e A2b de ZM241385 e MRS1754 também apresentou os mesmos efeitos sobre a sobrevivência do parasito e infectividade. Em estudo posterior, em busca de um possível papel da HIF- 1α na infecção por Leishmania, investigamos os efeitos da FM19G11, inibidor do HIF- 1α, na expressão de CD39 e CD73, bem como na infecção parasitária . Observou-se que, apesar de HIF - 1α poder influenciar na sobrevivência do parasito, os seus efeitos sobre a expressão de CD39 e CD73 não eram visíveis. Também foi avaliada, por PCR em tempo real, a expressão de receptores de adenosina em populações infectadas, nas quais não se observou nenhuma mudança significativa na expressão após 24 horas de infecção. Além disso, também foi avaliada a produção de citocinas, tais como TNF- α e IL-10 a partir da produção de NO nos grupos tratados. Surpreendentemente, não houve variação nos níveis destes mediadores, sugerindo a existência de outros mecanismos independentes da mediação por citocina para produção de Óxido Nítrico, tais como a produção de ROS ou efeitos leishmanacidas independentes do triptofano. Concluindo, nossos dados mostram que a infecção por L. amazonensis regula a expressão CD73 durante 24 horas de infecção e sua sobrevivência depende de atividades enzimáticas, bem como de receptores A2a e A2b.
Avaliação da participação de receptores do tipo toll na indução de resposta imune por Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20 .
(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2007) Freitas, Leonardo Santos de; Afonso, Luís Carlos Crocco
O uso de bactérias probióticas como adjuvantes de vacinas tem sido considerado uma importante estratégia para o aumento de eficácia desta ferramenta de combate às mais diversas patologias. Trabalhos recentes realizados com o candidato a adjuvante, Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20, demonstraram sua capacidade de induzir, in vitro, a produção das citocinas pró-inflamatórias IFN-γ, TNF-α e IL-12 por esplenócitos de camundongos BALB/c e células mononucleares do sangue periférico humano. Apesar da indução destas citocinas características de uma resposta imune TH1, esta estirpe bacteriana foi incapaz de proteger camundongos BALB/c da infecção por L. braziliensis, sugerindo uma possível regulação do processo inflamatório. A partir destes dados, decidiu-se caracterizar o perfil de resposta induzido por L. delbrueckii em esplenócitos de diferentes linhagens de camundongos, no intuito de compreender os mecanismos envolvidos no controle da resposta. Neste sentido, verificamos que o estímulo L. delbrueckii morto pelo calor determinou a produção de citocinas pró e antiinflamatórias, e também das quimiocinas CCL2 e CXCL10, sugerindo que esta preparação é capaz de induzir o recrutamento de macrófagos e células NK. Avaliou-se também a participação dos receptores do tipo Toll, mais precisamente TLR-2 e TLR-4, no reconhecimento do lactobacilo, e a importância deste processo na indução da resposta imune subseqüente. Os resultados obtidos nos experimentos com linhagens deficientes para estes receptores demonstraram a participação efetiva apenas do receptor TLR-2. Este dado foi comprovado pelos experimentos realizados com o extrato de parede do probiótico, em que a ausência do receptor levou à diminuição da indução de IFN-γ. A caracterização molecular desta fração da bactéria, por sua vez, demonstrou que esta possui naturezas glicídicas e lipídicas. Em síntese, nossos dados demonstraram que o lactobacilo estudado é capaz de induzir diferentes perfis de resposta imunológica e que esta capacidade é determinada de forma importante pela ativação de TLR-2.
Avaliação da utilização de Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20 como adjuvante na vacinação contra Leishmania braziliensis.
(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2005) Castro, Juciane Maria de Andrade; Afonso, Luís Carlos Crocco
Um dos grandes desafios na formulação de uma vacina efetiva contra Leishmania é a descoberta de um adjuvante com efeito imunomodulador que irecionem a resposta imune a um perfil de resistência aos parasitas, uma vez que as vacinas testadas até o momento não apresentam eficácia apropriada. O Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20 já teve seu efeito imunomodulador comprovado em camundongos, induzindo produção de IL-12, IFN- e TNF- in vitro, e aumentando o poder de eliminação de Escherichia coli patogênica por esses animais. Em células mononucleares do sangue periférico humano de voluntários sadios, induziu a produção de IL-12, IFN- e TNF- e estimulou a ativação de mecanismos efetores da imunidade inata, levando à diferenciação de linfócitos T virgens em linfócitos Th1 específicos para antígeno de Leishmania amazonensis. Neste trabalho, verificou-se a capacidade do Lact delbrueckii de proteger camundongos BALB/c contra infecção por Leishmania braziliensis, funcionando, assim, como adjuvante indutor de uma resposta que levaria a eliminação desse parasita. Verificouse que o Lact delbrueckii induziu a produção, in vitro, de altos níveis de IL-12, IFN- e TNF- por esplenócitos de camundongos BALB/c. Porém, quando inoculado na presença de antígeno de L. braziliensis, essa bactéria não foi capaz induzir proteção aos camundongos contra a inoculação de formas infectantes desse parasita. Esse resultado pode ser explicado pela indução concomitante da citocina IL-10 pelo Lact delbrueckii, o que ocasionaria uma supressão da resposta protetora. Diante dessas constatações, decidiu-se isolar a molécula do Lact delbrueckii responsável pela indução da produção de IL-12. Para isso, obteve-se um extrato de parede dessa bactéria. Esse extrato induziu IFN- , in vitro, de uma maneira peculiar e distinta à bactéria íntegra. A análise desse extrato revelou que a provável substância imunomoduladora possui característica glícidica e baixo peso molecular. Esses resultados demonstram a importância em se efetivarem estudos mais detalhados com o Lact. delbrueckii e outras bactérias probióticas no sentido de caracterizar seus componentes distintos envolvidos na indução diferencial de determinadas citocinas.
Avaliação do efeito do lipofosfoglicano (LPG) de Leishmania amazonensis e de Leishmania braziliensis na infecção por Leishmania
(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2008) Ambrósio, Roberta Passamani; Afonso, Luís Carlos Crocco
Na busca por novos medicamentos e formas de tratamento da Leishmaniose estudos têm sido direcionados à compreensão dos mecanismos de interação parasito/hospedeiro. A resposta inicial desencadeada pelo parasito parece ser crucial no direcionamento da infecção e no processo de cura ou resistência. A molécula de LPG, presente na superfície das formas promastigotas de protozoários do gênero Leishmania, por possuir grande variabilidade estrutural interespecífica tem se tornado objeto de estudo a fim de se elucidar mecanismos iniciais desta importante interação. Neste trabalho foram verificadas grandes diferenças na proporção da molécula de LPG de L. braziliensis e de L. amazonensis evidenciando a diversidade estrutural e/ou quantitativa deste glicolípide de superfície. Verificamos que a administração LPG de L. braziliensis e o LPG de L. amazonensis, em excesso, durante infecções por L. braziliensis, no modelo murino não foram capazes de alterar o perfil de lesão provocado pelo protozoário. No entanto células do baço e linfonodo de camundongos infectados com L. baziliensis na presença de LPG foram capazes de produzir a citocina IL-10, relacionada aos mecanismos de regulação da resposta imune celular. Além disto, LPGs purificados não foram capazes de ativar macrófagos intraperitoneais, porém, quando adicionados em conjunto com LPS e IFN-γ foram capazes de alterar o perfil de ativação quanto a produção de NO ou IL-10. O LPG de L. braziliensis tem efeito direto em macrófagos ativados diminuindo a produção de NO de maneira dose dependente, demonstrando efeito direto deste LPG na eliminação do protozoário pela célula hospedeira. No entanto, o LPG de L. amazonensis não induz tal efeito, porém, é capaz de diminuir a produção de IL-10. Receptores do Tipo Toll 2 (TLR2) parecem não estar envolvidos nestes processos. Apesar destas alterações provocadas pelos LPGs estudados tais moléculas não foram capazes de modificar a expressão, em macrófagos, de moléculas envolvidas na ativação, apresentação e migração celular. Nossos dados demonstram que a presença do LPG é capaz de induzir diferentes mecanismos da resposta imune durante a ativação de macrófagos, tal fato pode ocorrer devido à variabilidade da molécula entre as espécies de Leishmania. Este trabalho vem contribuir para elucidação de mecanismos complexos que envolvem a diversidade da resposta imune do hospedeiro e consequentemente a cura ou resistência a infecções por parasitos do gênero Leishmania.
Avaliação do uso de células dendríticas no tratamento da infecção experimental por Leishmania amazonensis.
(2020) Paixão, Pierre Henrique de Menezes; Afonso, Luís Carlos Crocco; Dias, Fátima Ribeiro; Soares, Rodrigo Dian de Oliveira Aguiar; Afonso, Luís Carlos Crocco
Leishmaniose é a denominação dada ao grupo de doenças causadas pelo parasito do gêne- ro Leishmania. Os sintomas e as manifestações clínicas da leishmaniose podem ser variados. Existem cerca de 20 espécies de parasito do gênero Leishmania e dois tipos principais de mani- festações clínicas: a leishmaniose visceral e a leishmaniose tegumentar. A Leishmaniose tegu- mentar americana pode ser subdividida em diferentes formas clínicas, dentre elas a leishmaniose difusa com lesões difusas não ulceradas ricas em parasitos cuja Leishmania amazonensis é um dos principais agentes etiológicos da doença. O objetivo do trabalho foi desenvolver um trata- mento imunoquimioterápico na infecção experimental por L.amazonensis e, além disso, avaliar se o tratamento seria capaz de gerar memória imunológica durante uma reinfecção. Utilizando células dendríticas incubadas com o MRS1754, um antagonista seletivo do receptor A2B de ade- nosina e metacíclicas de L. amazonensis mortas pelo calor (DLM) associado ao fármaco miltefo- sina (Milt). Os camundongos C57BL/6 receberam um inóculo de 103 formas metacíclicas de L. amazonensis na orelha esquerda. Na oitava semana de infecção os animais foram tratados com 2 x 105 DLM e uma semana após o tratamento, os animais receberam o tratamento com a miltefosina por 15 dias consecutivos. Na décima sexta semana pós-infecção dois grupos de ani- mais receberam um segundo inóculo na orelha direita com 103 metacíclicas de L. amazonensis. Os animais foram acompanhados por até trinta e três semanas pós-infecção, após esse período foram feitas a quantificação da carga parasitária na orelha e a dosagem das citocinas IL-10 e IFN-γ produzidas por células de linfonodo estimuladas in vitro com antígeno de Leishmania. Os animais tratados com DLM associado à miltefosina (MDLM) apresentaram uma menor carga parasitária e uma menor lesão quando comparados com os animais que foram tratados com mil- tefosina. A produção das citocinas não mostrou uma clara relação com a carga parasitária. Os resultados obtidos sugerem que o tratamento com MDLM pode ser mais eficaz do que utilizando apenas a miltefosina. Não houve geração de memória imunológica, os animais que foram rein- fectados tiveram desenvolvimento da lesão e da carga parasitária.
Características da resposta imune desenvolvida frente à infecção por Leishmania (Leishmania) amazonensis mantida em cultura axênica por passagens sucessivas.
(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2009) Testasicca, Miriam Conceição de Souza; Afonso, Luís Carlos Crocco
Diferentes espécies de parasitos do gênero Leishmania causam infecções expressivamente distintas em uma mesma espécie de hospedeiro. Enquanto alguns hospedeiros são resistentes à infecção por diversas espécies do parasito, quase todas as linhagens de camundongos são susceptíveis à infecção por L. amazonensis, desenvolvendo lesões crônicas e progressivas em resposta à infecção. Esta pronunciada virulência dos parasitos pode estar relacionada à expressão de moléculas superficiais que favoreçam sua interação com os hospedeiros. As ecto-enzimas envolvidas no metabolismo de nucleotídeos são um possível fator de virulência para parasitos do gênero Leishmania. Para caracterizar a resposta imune desenvolvida por animais infectados com parasitos que apresentam distintos perfis de atividade ectonucleotidásica, foram avaliadas infecções por L. amazonensis mantida em cultura por poucas ou muitas passagens. Esses parasitos, quando mantidos em cultura axênica por muitas passagens, apresentam menor virulência, bem como menor atividade ectonucleotidásica. A atividade das suas enzimas envolvidas no metabolismo de nucleotídeos extracelulares pode ser modulada pela cultura em presença de determinadas moléculas. Assim, os parasitos cultivados em meio suplementado com adenosina, produto final da via catabólica, apresentam redução na sua capacidade hidrolítica e levam a lesões menores em camundongos C57BL/6. Já os parasitos submetidos a muitas passagens em cultura, quando cultivados em meio suplementado com suramina, um inibidor de ecto-ATPases, apresentam aumento na capacidade de hidrólise de ATP e causam lesões maiores em camundongos C57BL/6. De modo interessante, os animais infectados com os parasitos que apresentam maior atividade ATPásica produziram menores quantidades de IFN- , após oito semanas de infecção. A infecção de macrófagos pelos parasitos mantidos em cultura axênica por poucas ou muitas passagens também apresenta diferenças marcantes, tanto para macrófagos peritoneais, quanto para macrófagos derivados de medula óssea. Os parasitos mantidos em cultura por poucas passagens são capazes de infectar maior proporção de macrófagos; entretanto, não são observadas grandes diferenças no parasitismo celular. Não há alterações na produção de citocinas, quimiocinas e NO pelas células infectadas pelos diferentes parasitos. Dados obtidos in vivo permitem inferir que células T reguladoras naturais parecem ser importantes para o retardo do desenvolvimento da lesão. Porém, sua participação parece ser idêntica em animais infectados com parasitos mantidos em cultura axênica por poucas ou muitas passagens. Após uma semana de infecção, há maior produção da quimiocina CCL2 em animais infectados com parasitos mantidos em cultura por poucas passagens. Como esta quimiocina participa do recrutamento de monócitos, pode-se cogitar que os parasitos mantidos em cultura por poucas passagens promovem um maior recrutamento dessas células para o sítio da infecção. Uma vez diferenciadas em macrófagos, são eficazmente infectadas por estes parasitos. Em conjunto, esses resultados demonstram que as enzimas envolvidas no metabolismo de nucleotídeos extracelulares desempenham um papel importante na infecção por L. amazonensis, podendo ter função direta na aderência do parasito às células-alvo e na modulação da resposta imune subseqüente.
Correlação entre atividade ecto-nucleotidásica, infecciosidade e evolução clínica em isolados de Leishmania (Viannia) braziliensis.
(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2012) Leite, Pauline Martins; Afonso, Luís Carlos Crocco
Correlação entre capacidade ectonucleotidásica de isolados de Lactobacillus e a produção de citocinas por células dendríticas.
(2014) Pereira, Hellem Crhistina Damazo; Afonso, Luís Carlos Crocco; Neumann, Elisabeth
Probióticos são microrganismos vivos que, quando administrados de forma adequada, agregam benefícios à saúde do hospedeiro. Várias espécies do gênero Lactobacillus apresentam efeito probiótico comprovado e são importantes moduladoras do sistema imune intestinal. Os probióticos estimulam as células dendríticas (DCs) a produzirem citocinas que diferenciam as células T em Th1, Th2, Th17 ou Treg. As ectonucleotidases são enzimas capazes de hidrolisar nucleotídeos di e trifosfatados. Essas ectoenzimas são importantes para a modulação da resposta imune intestinal devido à hidrólise de ATP, que quando aumentada no meio extracelular é considerada uma molécula inflamatória. Por outro lado o acúmulo de adenosina, através da hidrólise de ATP em AMP, pela 5’-nucleotidase, estimula a resposta anti-inflamatória. O objetivo do trabalho foi relacionar a atividade ectonucleotidásica de diferentes linhagens de Lactobacillus com a capacidade de ativação de DCs e a produção de citocinas. Os Lactobacillus foram incubados com ATP, ADP ou AMP e os níveis de hidrólise foram avaliados através da liberação de fosfato inorgânico (Pi). Demonstrouse que os lactobacilos hidrolisam ATP diferentemente, dependendo da linhagem, sendo que Lactobacillus mali L.11 e Lactobacillus acidophilus L.36 apresentaram maior capacidade de hidrólise de ATP. Não foi observado hidrólise significativa de ADP e AMP. Ao agruparmos as linhagens com e sem atividade, foi possível verificar o aumento significativo da atividade de L. mali L.11 e L. acidophilus L.36 quando comparado às linhagens que apresentaram pouca atividade ectonucleotidasica. Além disso, as DCs foram estimuladas com os lactobacilos, por 20 horas e os resultados dessa estimulação demonstrou que as linhagens não alteraram. Além disso, as DCs foram estimuladas com Lactobacillus, por 20 horas e não demonstrou alteraração na expressão de CD40, CD86 e MHCII. Por fim observou-se a produção de citocinas após a estimulação por 20 horas. Houve um aumento de IL-6, TNF- α e IL-10 em relação às DCs não estimuladas. De maneira interessante, IL-12 teve a produção aumentada quando da estimulação de DC com L. mali L.10, que também mostrou baixa capacidade de hidrolisar ATP. Curiosamente, L. mali L.11 e L. acidophilus L.36 mostraram uma diminuição significativa da produção de IL-12, o que pode está relacionado com a alta capacidade de hidrólise dessas cepas. Conclui-se então que Lactobacillus possuem capacidade ectonucleotidásica diferenciada e que a hidrólise de ATP pode ser relacionada com a produção de citocinas por DCs e, consequentemente, com a diferenciação de linfócitos T durante a resposta imune intestinal.
Desenvolvimento de nanossistemas e avaliação biológica em modelos experimentais de infecção pelo Trypanosoma cruzi e Plasmodium sp.
(2014) Oliveira, Líliam Teixeira; Mosqueira, Vanessa Carla Furtado; Diniz, Lívia de Figueiredo; Afonso, Luís Carlos Crocco; Oliveira, Mônica Cristina de; Magalhães, Nereide Stela Santos; Mosqueira, Vanessa Carla Furtado
A malária e a doença de Chagas são duas doenças parasitárias de grande importância em termos de morbidade e mortalidade no mundo. Entretanto, a quimioterapia disponível é até o momento, com algumas limitações. A nanotecnologia é uma estratégia nova e foi foco deste trabalho para o desenvolvimento de nanocarreadores adequados para o tratamento dessas duas doenças. A administração intravenosa de diferentes doses e tipos de nanocápsulas (NC) poliméricas de ácido poli-(D,L)-lático (PLA), ácido poli- (D,L)-lático-co-polietilenoglicol (PLA-PEG) e ácido poli-(D,L)-lático adsorvido com quitosana (PLAQUI) em camundongos infectados pelo P. berghei NK65 não induziu nenhuma diferença na sobrevida dos animais, nenhum efeito tóxico adicional ou alteração no curso da infecção, o que permitiu concluir que esses polímeros nas doses estudadas são seguros para o encapsulamento de fármacos antimaláricos e não possuem efeitos sobre o parasito. Foram encapsulados dois inibidores da síntese de fosfolípides pelo P. falciparum em NC e nanoemulsões (NE), albitiazolium e TE3, que estão em fase II do estudo clínico. As formulações foram testadas in vivo em camundongos infectados pelo P. vinckei pelas vias intraperitoneal (ip) e oral em diferentes doses. Foi observada redução de 37% da parasitemia no grupo tratado com NC-TE3 na dose 3 mg/Kg ip, mas sem aumento da sobrevida. Essas formulações não foram eficientes na melhoria da eficácia e da biodisponibilidade oral. O benzonidazol (BZ) por outro lado é o único fármaco disponibilizado no Brasil para o tratamento da Doença de Chagas e possui sérios efeitos adversos. Com objetivo de melhorar a eficácia terapêutica e diminuir os efeitos adversos do BZ foram desenvolvidas três formulações farmacêuticas autonanoemulsionáveis (SNEDDS) e uma formulação de NC polimérica de PLA carreando o BZ, elas foram caracterizadas quanto à distribuição de tamanho das dispersões por diferentes técnicas, espectroscopia de correlação de fótons (EDL), microscopia de força atômica (MFA) e fracionamento em campo de fluxo assimétrico (AsF4). Após contato dos SNEDDS com a água evidenciou-se a formação de nanoemulsões monodispersas estáveis com tamanho médio menor que 300 nm. O BZ associado aos SNEDDS teve sua biodisponibilidade relativa aumentada em 142% em relação à suspensão dos comprimidos, aumento da ASC (1,4 vezes), do t1/2 (7 vezes) e do tempo de residência plasmática (1,15 vezes) em camundongos sãos. A eficácia biológica em camundongos infectados com a cepa Y do T. cruzi parcialmente sensível ao BZ, indicou maior eficácia na cura de camundongos com um quarto das doses usuais (10 doses de 50mg/Kg). As NC de BZ não foram eficazes pela via IP e induziram um processo inflamatório no local da injeção que reduziu a sobrevida dos animais. O BZ na forma de suspensão do comprimido (50 mg/Kg/dia durante 20 dias) aumentou a permeabilidade intestinal de animais, enquanto as SNEDDS-BZ ou brancas não induziram nenhuma alteração da permeabilidade intestinal no mesmo período de tratamento. No modelo de toxicidade aguda, as formulações com BZ (100 mg/Kg) e algumas doses de SNEDDS (10, 50 e 100 mg/Kg) se mostraram bastante tóxicas induzindo leucopenia, anemia e alterações hepáticas e renais, particularmente nos camundongos machos. As formulações de SNEDDS-BZ se mostraram promissoras no aumento das concentrações plasmáticas do BZ e no aumento da eficácia com menores doses de BZ. Entretanto o regime de doses precisa ser melhorado para reduzir a toxicidade do fármaco associado a essas formulações.
E-NTPDase-2 de Leishmania amazonensis é importante na adesão do parasito ao macrófago e participa da modulação da resposta inflamatória, de forma dependente e independente da atividade ectonucleotidás.
(2015) Gomes, Rodrigo Saar; Afonso, Luís Carlos Crocco; Afonso, Luís Carlos Crocco; Horta, Maria de Fátima Martins; Oliveira, Camila Indiani de; Bezerra, Frank Silva; Diniz, Lívia de Figueiredo
As NTPDases (nucleosídeo trisfosfato difosfohidrolases) são enzimas com a habilidade de hidrolisar nucleotídeos di e trifosfatados sob estímulo de íons bivalentes (Ca2+ ou Mg2+). São encontradas em diversos tipos celulares, incluindo protozoários, como parasitos do gênero Leishmania. Dada a relação entre a expressão e a atividade de Ecto-NTPDase de L. amazonensis e a capacidade do parasito em causar lesão em camundongos, decidimos investigar os mecanismos pelos quais essa enzima participa da infecção em macrófagos, a principal célula hospedeira para Leishmania. Primeiramente investigamos o papel da expressão dessa enzima na adesão à célula hospedeira. Observamos que promastigotas metacílicas que possuem alta expressão de E-NTPDase-2 aderem mais à células J774. A inibição da expressão dessa enzima por cultivo em meio suplementado com adenina reduz a adesão e internalização dos parasitos. Demonstramos, ainda, que o bloqueio da enzima por anticorpo antiNTPDase-2 de Leishmania resulta numa redução da adesão e internalização dos parasitos. Em formas amastigotas, por outro lado, a atividade e expressão da enzima é bastante reduzida e não parece ter nenhum efeito sob a infecção dessas formas. Tendo comprovado o papel da E-NTPDase-2 na adesão e internalização de L. amazonensis na célula hospedeira, objetivamos identificar o receptor de macrófagos envolvido nesse processo. Resultados anteriores levantaram a hipótese que o CR3 estaria envolvido nessa ligação. O bloqueio desse receptor com anticorpo anti-CD11b foi capaz de reduzir drasticamente a ligação e internalização de NTPDase recombinante, como demonstrado por microscopia confocal. Decidimos ainda investigar se a presença da enzima interfere com a sobrevivência do parasito em macrófagos estimulados por IFN-e LPS. Observamos que parasitos de alta atividade e expressão de E-NTPDase-2 sobrevivem mais em células ativadas, por reduzirem a produção de NO por essas células. A inibição da atividade ectonucleotidásica dos parasitos da cepa PH8, por incubação dos parasitos com DIDS, reduz a capacidade de L. amazonensis de modular a produção de NO e sobreviver em macrófagos estimulados. Além disso, a infecção por L. amazonensis reduz a produção de citocinas inflamatórias TNF-α e IL-12. Essa modulação é revertida em parasitos tratados com DIDS. Para investigar se a adenosina é responsável pela inibição da resposta inflamatória, a infecção foi realizada na presença de antagonistas específicos dos receptores de adenosina A2A ou A2B. O bloqueio dos receptores A2B reduziu a sobrevivência do parasito no interior das células estimuladas. Isso está associado com um aumento na produção de NO, IL-12 e TNF-α. Tomados em conjunto, estes resultados mostram que a atividade de E-NTPDase-2 em L. amazonensis é importante para a geração de substrato para a produção de adenosina que, ao atuar sobre os receptores A2B, reduz a produção de IL-12 e TNF-α, citocinas que são essenciais para a produção de NO pelas células estimuladas, favorecendo a infecção. Por fim, para investigar se a enzima teria um papel direto na modulação da resposta imune, tratamos macrófagos com rNTPDase de Leishmania por 3 horas. As células foram lavadas e estimuladas por 48 horas na presença de IFN-e LPS. Observamos que mesmo na ausência de atividade ectonucleotidásica, a enzima recombinante é capaz de modular a produção de NO, IL-12 e TNF-α. A inibição da atividade por DIDS ou o bloqueio dos receptores de adenosina não impede que a rNTPDase tenha um efeito imunomodulador. Mais ainda, demonstramos que quando o CD11b das células foi bloqueado por anticorpo específico, a rNTPDase perdeu a capacidade em modular a resposta inflamatória. Em síntese, demonstramos que a E-NTPDase-2 de L. amazonensis é importante na adesão do parasito à células hospedeira pela ligação ao receptor CD11b e reduz a produção de NO e citocinas inflamatórias de maneira dependente e independente da atividade ectonucleotidásica.
Efeito da administração diária de cafeína sobre a infecção por Leishmania amazonensis.
(2017) Carvalho Júnior, Jaime Márcio de; Afonso, Luís Carlos Crocco; Testasicca, Miriam Conceição de Souza; Afonso, Luís Carlos Crocco; Bahia, Maria Terezinha; Maioli, Tatiani Uceli
A leishmaniose pode ser descrita como um conjunto de manifestações clínicas causadas pela infecção de protozoários do gênero Leishmania. Essas manifestações clínicas podem ser agrupadas em quatro quadros bem definidos: leishmaniose cutânea localizada, leishmaniose muco-cutânea, leishmaniose visceral e leishmaniose cutânea difusa. As diferentes condições dependerão de fatores inerentes ao hospedeiro humano e por características do parasito. Por exemplo, L. amazonensis é o único causador da leishmaniose cutânea difusa. Para essa condição clínica o balanço das citocinas produzidas pelas células T CD4 positivas é de grande importância. A infecção por L. amazonensis resulta no desenvolvimento de uma fraca resposta celular T CD4 Th1 em pacientes que são negativos para a reação de hipersensibilidade a antígenos de Leishmania. A deficiência na resposta celular pode ser consequência de mecanismos de evasão específicos de L. amazonensis que podem induzir imunossupressão no hospedeiro. A presença de ectonucleotidases e produção de adenosina extracelular pode representar um desses mecanismos. Atuando nesses receptores, a adenosina pode induzir respostas antiinflamatórias, o que favorece a multiplicação do parasito. Sendo a cafeína por sua vez, uma metilxantina capaz de antagonizar os efeitos da adenosina nos receptores P1, nosso objetivo foi investigar os efeitos da administração diária de cafeína sobre a infecção por L. amazonensis no modelo murino. Camundongos C57BL/6J foram tratados com diferentes concentrações de cafeína em água de beber e posteriormente infectados com metacíclicas de L. amazonensis. Os animais tratados com cafeína apresentaram menor tamanho de lesão quando comparados com os animais não tratados e não observamos diferença no número de parasitos na lesão. A produção de IFN-ɣ por células do linfonodo foi significativamente maior nos animais tratados com cafeína. Concluímos, portanto, que o tratamento com cafeína possuiu a capacidade de interferir no curso da infecção por L. amazonensis. Essa interferência pode ser explicada pela alteração na produção de citocinas como o IFN-ɣ. Dessa maneira o tratamento com cafeína pode oferecer mais um meio de expandir os conhecimentos a respeito dos mecanismos de evasão da resposta imune utilizados pelo parasito, através da sinalização purinérgica, e melhorando o entendimento do papel desta via no curso da infecção por L. amazonensis.
Efeito de ectonucleotidases de Leishmania sobre a produção de IL-1β em células dendríticas.
(2018) Carvalho, Luana Cristina Faria; Afonso, Luís Carlos Crocco; Afonso, Luís Carlos Crocco; Silva, André Talvani Pedrosa da; Machado, Fabiana Simão
Células dendríticas (DC) são essenciais para a montagem da resposta imune inata e para a conexão das respostas inata e adquirida, inclusive durante a infecção por Leishmania. Vários estudos têm apresentado a importância da sinalização purinérgica, como o papel das ENTPDases do parasito, no processo de infecção. O objetivo deste trabalho foi avaliar se Leishmania com variações na atividade ENTPDase são capazes de modular a produção de IL1β por células dendríticas. A atividade ectonucleotidásica foi avaliada pela hidrólise de fosfato inorgânico por incubação de formas promastigotas metacíclicas de L. amazonensis e L. major com ATP, ADP ou AMP. Observamos que ambas apresentam semelhante atividade enzimática. Avaliamos a correlação entre liberação de IL-1β por DC infectadas por Leishmania e tratadas com LPS e ATP e atividade enzimática de Leishmania e verificamos que houve forte correlação, sobretudo sobre ATP e ADP. Além disso, uma vez reduzida a atividade enzimática, houve uma redução do percentual de células infectadas. Como adenosina poderia estar envolvida no processo de indução da liberação de IL-1β verificamos que o tratamento de DC com análogo de adenosina aumentou a liberação de IL-1β. Verificamos, ainda, que o tratamento com inibidores dos receptores de adenosina, SCH 58261 (receptor A2a) e MRS 1454 (receptor A2b) foi capaz de reduzir significativamente a liberação de IL-1β por DC infectadas. Não obstante, verificamos o envolvimento do receptor P2X7 no processo de geração de IL-1β e analisamos que o bloqueio do receptor por P2X7 suficiente para reduzir a liberação de IL-1β pelas DC infectadas tanto por L. amazonensis como por L. major. Concluímos que a ENTPDase de Leishmania é um importante fator de virulência, capaz de induzir a hidrólise de ATP para geração de adenosina e estimular o possível curso da infecção em favor do parasito pela produção de IL-1β.
Efeito do bloqueio do receptor de IL-10 na resposta imune contra Leishmania amazonensis.
(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2002) Amaral, Joana Ferreira do; Afonso, Luís Carlos Crocco
A avaliação do papel da IL-10 na leishmaniose é de extrema importância, pois sendo uma citocina anti-inflamatória, inibe a ação de IFN-ge NO, que têm papel importante na eliminação do parasita e no controle da lesão. O papel da IL-10na infecção por L.(L.) amazonensis foi avaliado in vivo neste trabalho tratando-se camundongos C57BL/6, suscetíveis à essa espécie de Leishmania, comanticorpos monoclonais anti-receptor de IL-10(a-IL-10R) na fase inicial da infecção. Como controle de tratamento inoculamos um grupo de animais com IgG total de rato na mesma dose usada para o anticorpoa-IL-10R(0,5mg/animal/dose) e mantivemos outro grupo sem nenhum tratamento. Os animais tratados coma-IL-10R, após 3semanas de infecção, apresentaram perfil histopatológico, produçãodeTNFequantificaçãodeparasitas semelhanteaos grupos controle, com exceção da produção de IFN-g produzido por células mononucleares de linfonodo de camundongos tratados com a-IL-10R, que apresentaram quantidades dessa citocina superiores aos animais controles. Em relação aos animais sacrificados 12 semanas após a infecção, o curso da infecção, o parasitismo e a produção de citocinas foram semelhantes para todos os grupos. Em relação à análise histológica, observamos um maior infiltrado inflamatório e um parasitismo tecidual ligeiramente mais acentuado no grupo tratado coma-IL-10 R em relação aos controles. Dessa forma, podemos concluir que outros mecanismos de escape do parasita, Que não a produção de IL-10, estejam envolvidos na infecção por L.(L.) amazonensis, já Que mesmo em presença de um aumento da produção de IFN-g a infecção permanece inalterada. A indução da produção de TGF-b por parte do parasita, assim como a resistência daL.(L.) amazonensis à ação do NO em comparação a outras espécies de Leishmania são levantados como hipótes
Efeitos da dieta hiperlipídica sobre o desequilíbrio redox e a resposta inflamatória pulmonar e sistêmica em camundongos submetidos à ventilação mecânica.
(2017) Souza, Ana Beatriz Farias de; Bezerra, Frank Silva; Menezes, Rodrigo Cunha Alvim de; Afonso, Luís Carlos Crocco; Nagato, Akinori Cardozo; Bezerra, Frank Silva
A obesidade é uma doença de etiologia complexa e multifatorial influenciada por fatores genéticos, sociais e ambientais. O aumento da adiposidade leva a um quadro inflamatório crônico e provoca alterações em diversos sistemas como o sistema respiratório. Evidências mostram que ambiente hospitalar pacientes obesos cursam com mais complicações e necessitam de maior tempo suporte ventilatório. A ventilação mecânica (VM) é uma ferramenta utilizada em pacientes que apresentam insuficiência respiratória, embora apresente um papel terapêutico a VM pode induzir ou agravar uma lesão pulmonar. O presente trabalho teve por objetivo avaliar os efeitos de uma dieta rica em lipídeos saturados sobre o desequilíbrio redox, resposta inflamatória pulmonar e sistêmica de camundongos submetidos ventilação mecânica. Para isso 40 camundongos C57BL/6 machos, 8 a 9 semanas, foram inicialmente divididos em dois grupos: controle, que recebeu uma dieta com 3,4% de lipídeos, e dieta, que receberam uma dieta com 45% de lipídeos. Os animais tiverem livre acesso a ração durante 10 semanas ao término do protocolo nutricional os grupos foram novamente divididos em quatro grupos: grupo controle (GC), Grupo ventilação mecânica (GVM), grupo dieta (GD) e grupo dieta ventilação mecânica (GDVM). Os animais dos grupos GVM e GDVM foram submetidos à ventilação mecânica por 60 minutos. Posteriormente todos os animais foram eutanasiados e foi coletado o lavado bronco alveolar, sangue, pulmão e tecido adiposo para a realização das análises bioquímica, histológicas e morfométricas. Os resultados mostraram que o grupo dieta a partir da terceira semana de experimento apresentou maior massa corporal quando comparado com o grupo controle. O índice de adiposidade corporal foi maior nos grupos GD e GDVM quando comparado com os grupos GC e GVM. Há um aumento significativo na concentração de colesterol plasmático nos grupos que receberam a dieta hiperlípidica quando comparado com os grupos que receberam a dieta padrão. O influxo de células para o lavado aumentou no GD quando comparado com o GC. Os animais do grupo GVM apresentaram um influxo de células ainda maior quando comparado com GC e GD, o influxo celular causado pela VM foi potencializado nos animais alimentados com uma dieta rica em lipídeos. A contagem diferencial de células do lavado mostrou um influxo de macrófagos no grupo GD quando comparado com GC e um influxo de macrófagos, neutrófilos e linfócitos nos grupos submetidos à VM quando comparado com os grupos GC e GD. Foi observado um aumento da oxidação de proteínas nos grupos GVM e GDVM em comparação com GC e GD. A peroxidação lipídica foi maior no grupo submetido à ventilação mecânica quando comparado com GC, GD e GDVM. A atividade de superóxido dismutase no homogeneizado pulmonar foi maior em GVM e GDVM em comparação com o controle. A atividade de catalase foi menor no em GD quando comparado com o GC e nos grupos submetidos à VM foi menor quando comparado com os grupos GC e GD. Os níveis de CCL2 e IL-22 nos grupos VMG e DVMG foi maior quando comparado com os grupos não submetidos à ventilação, entretanto os níveis de IL-10 e Il-17 nos grupos GVM e GDVM foi menor quando comparado com GC e GD. Portanto, a obesidade e à VM promoveram inflamação e estresse oxidativo pulmonar em camundongo C57BL/6 adultos.
A expressão de RNAm de SmATPDase 1 E SmATPDase 2 em ovos de Schistosoma mansoni modula, via il-10 : o sistema imune de indivíduos infectados.
(2020) Gomides, Thalisson Artur Ribeiro; Afonso, Luís Carlos Crocco; Carvalho, Andréa Teixeira de; Leite, Pauline Martins; Pinto, Priscila de Faria; Fietto, Juliana Lopes Rangel; Vieira, Paula Melo de Abreu; Lima, Wanderson Geraldo de; Carvalho, Andréa Teixeira de; Leite, Pauline Martins; Afonso, Luís Carlos Crocco
A esquistossomose é uma doença crônica e debilitante que afeta mais de 200 milhões de pessoas em todo o mundo. A formação de granulomas ao redor dos ovos do parasito é mediada por células T CD4 +, e estudos recentes forneceram informações sobre a cascata de citocinas que controla o desenvolvimento da doença. A citocina IL-10 apresenta um papel central na regulação das respostas Th1 e Th2 frente aos antígenos do schistossoma, inibindo a expressão de moléculas co-estimuladoras, contribuindo para o estabelecimento do parasito. As SmATPDases degradam os nucleotídeos extacelulares ATP e ADP em AMP e podem inibir a inflamação mediada por ATP e a trombose mediada por ADP. Hidrólise adicional do AMP gera adenosina, uma molécula com propriedades antiinflamatórias. Essa ação pode modular a resposta imune do hospedeiro e favorecer a sobrevivência do parasito. Neste trabalho, avaliamos a expressão das enzimas SmATPDase 1 e SmATPDase 2 em ovos de S. mansoni obtidos de indivíduos infectados como um possível fator relacionado ao parasito que pode influenciar a resposta imune do hospedeiro e, consequentemente, o desfecho clínico da doença. Amostras de fezes foram coletadas de 39 indivíduos infectados para detectar regiões codificantes das enzimas pela qPCR. A produção de citocinas foi medida em sobrenadantes de culturas de PBMC estimuladas com SEA por ensaio multiplex. A determinação da mediana global de cada citocina foi realizada para caracterização dos indivíduos em altos produtores (AP) de citocinas (indivíduos que apresentaram índices de citocinas acima da mediana global). Observou-se que 6 indivíduos expressaram SmATPDase1 em suas amostras fecais, 6 expressaram SmATPDase2 e 6 expressaram ambas as enzimas. O grupo que expressou apenas a SmATPDase1 apresentou alta frequência de AP para IFN-γ, TNF e IL-4 e baixa frequência de AP para IL-6. O grupo que expressou apenas a SmATPDase2 apresentou alta frequência de AP para IFN-γ, IL-6 e IL-4 e baixa frequência de AP para IL-10. O grupo que expressou ambas enzimas apresentou alta frequência de AP para IL-10 e baixas frequências de AP para IFN-γ, IL-6, IL-2, IL-4 e IL-13. Ao comparar a razão entre IL10/IFN-γ após estímulo com SEA, observou-se que a expressão de ambas as enzimas modula a produção de IFN-γ através da ação da citocina IL-10. Curiosamente, a expressão de SmATPDases contribuiu para a associação positiva entre a intensidade da infecção e o índice de IL-10, uma vez que a correlação positiva entre a intensidade da infecção e os níveis de IL-10 ocorreu apenas no grupo SmATPDase positivo. O gráfico de radar revelou que 62,5% das citocinas analisadas apresentaram frequência reduzida no grupo de indivíduos que expressam ambas enzimas, enquanto a IL-10 manteve uma frequência de altos produtores acima de 50%. Além disso, a análise do diagrama de Venn mostrou que a IL-10 é a única citocina induzida pela expressão de ambas as enzimas ao mesmo tempo. Finalmente, a expressão de SmATPDases em amostras de fezes mostrou-se relevante para o agrupamento de indivíduos junto a dados sociodemográficos, parasitológicos e imunológicos. Assim, a expressão de ambas as enzimas em ovos do parasito parece ser um novo fator, ainda não descrito, capaz de modular negativamente a resposta imune do hospedeiro, através da produção de IL-10 o que pode contribuir para a sobrevivência do parasito.
Implicações do consumo de dieta hiperlipídica nas respostas defensivas comportamentais associadas às alterações do eixo intestino-encéfalo.
(2019) Noronha, Sylvana Izaura Salyba Rendeiro de; Menezes, Rodrigo Cunha Alvim de; Chianca Júnior, Deoclécio Alves; Menezes, Rodrigo Cunha Alvim de; Chianca Júnior, Deoclécio Alves; Aguiar, Daniele Cristina de; Moreira, Fabrício de Araújo; Afonso, Luís Carlos Crocco; Cota, Renata Guerra de Sá
O sobrepeso e a obesidade são uma pandemia mundial que afeta bilhões de pessoas. Essas condições têm sido associadas a um estado inflamatório crônico de baixo grau, reconhecido enquanto fator de risco para o desenvolvimento de uma variedade de doenças somáticas, bem como transtornos do neurodesenvolvimento, transtornos de ansiedade, transtornos relacionados a eventos traumáticos estressores e transtornos afetivos. A ingestão de DH é uma das razões para mudanças na comunidade microbiana intestinal, e evidências recentes apontam que estas comunidades são fortemente relacionadas à homeostase de diversos órgãos e do SNC. Alterações da microbiota podem ocorrer por uma variedade de razões, dentre eles o tipo de composição química dos alimentos. Nosso grupo relatou anteriormente que a ingestão de uma dieta rica em gordura (DH; 45% de gordura kcal/g) por 9 semanas foi capaz de induzir obesidade em ratos, em paralelo ao aumento da reatividade ao estresse e aumento do comportamento defensivo relacionado à ansiedade. Neste estudo, induzimos ratos à obesidade e investigamos alterações das respostas comportamentais defensivas relacionadas à ansiedade por meio do labirinto em T-elevado (LTE), labirinto em Cruz-elevado (LCE), caixa claro/escuro (CE) e campo aberto (CA). A imunoreatividade-FOS após exposição ao teste comportamental no LTE foi quantificado para esquiva e fuga. Analisamos a produção de citocinas proinflamatórias e expressão gênica em núcleos encefálicos (i.e., hipotálamo e amigdala). Avaliamos a expressão gênica de tph2 e slc6a4 no núcleo dorsal da rafe (DR) e subdivisões adjacentes. Investigamos as respostas termorregulatória da região interscapular e da cauda, durante o estresse e recuperação. Foi feito a caracterização das comunidades microbianas em relação às métricas alfa, beta e taxonômica dos grupos controle e obesos. Demonstramos que nove semanas de ingestão de DH induzem obesidade, em associação à hipertrofia do tecido adiposo abdominal, promove resposta comportamental defensiva do tipo ansiedade, aumenta a produção de proteínas próinflamatórias em núcleos hipotalâmicos e amigdaloides, altera a expressão gênica do IL-4 e seu receptor no hipotálamo, aumenta a expressão gênica de tph2 e slc6a4 em diferentes subdivisões da DR e da porção mediana da rafe, e impacta de forma estrutural as comunidades microbianas intestinal. A obesidade alterou a reatividade das estruturas cerebrais envolvidas no controle de respostas neuroendócrinas, autonômicas e comportamentais, isto é, aumento de células imunorreativas-FOS nos núcleos hipotalâmicos ventricular (PVN), dorsomedial (DMH), ventromedial (VMH) e basolateral da amígdala (BLA). Os resultados obtidos sugerem que a DH induz neuroinflamação, produz excitabilidade nos núcleo encefálicos envolvidos nas respostas neuroendócrinas, autonômicas e comportamentais, e modificam a composição da microbiota intestinal.
Influência da manutenção de Leishmania (Leishmania) amazonensis em meio de cultura axênico sobre a infecciosidade dos parasitos e sua correlação com a atividade ecto-nucleotidásica.
(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2008) Assis, Elisângela Aparecida de; Afonso, Luís Carlos Crocco
Parasitos pertencentes ao gênero Leishmania quando são mantidos em cultura por passagens sucessivas apresentam redução na infecciosidade. As cepas infectantes dos parasitos possuem maior atividade ecto-nucleotidásica do que as não infectantes. Para avaliar a existência de correlação entre o tempo de manutenção em cultura, a infecciosidade e a hidrólise de nucleotídeos em Leishmania amazonensis o parasito citado foi mantido em cultura por passagens sucessivas. Os parasitos mantidos em cultura por poucas passagens (p<15) apresentaram maior hidrólise dos nucleotídeos ATP, ADP e AMP e maior porcentagem de formas infectantes quando comparados com aqueles mantidos em cultura por várias passagens (p>100). Para avaliar o curso da infecção causada por passagens diferentes do parasito, os camundongos C57BL/6 foram inoculados na pata com formas promastigotas totais ou metacíclicas. O curso da infecção foi acompanhado por um período de oito semanas. Os camundongos inoculados com os parasitos mantidos em cultura por poucas passagens desenvolveram lesões maiores e produziram IFN- em menor quantidade quando comparados com o grupo de animais que recebeu o inóculo dos parasitos mantidos em cultura por várias passagens. Não foi verificada a produção de IL-4. O re-isolamento de parasitos, dos animais inoculados com os parasitos mantidos em cultura por várias passagens, mostra que apenas uma passagem pelo hospedeiro vertebrado não alterou a atividade ecto-nucleotidásica. O observado indica que a manutenção dos parasitos em cultura pode selecionar aqueles que apresentam reduzida atividade ecto-nucleotidásica. O tratamento dos parasitos mantidos em cultura por poucas passagens com adenosina causou alteração no metabolismo de nucleotídeos e na infecciosidade dos mesmos. Os dados sugerem a existência de correlação entre o tempo de manutenção em cultura, a infecciosidade e a atividade ecto-nucleotidásica em L. amazonensis.
Influência do metabolismo extracelular de ATP em infecções por parasitos do gênero leishmania.
(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2008) Silva, Eduardo de Almeida Marques da; Afonso, Luís Carlos Crocco
Variações nos quadros clínicos da leishmaniose, observadas tanto na doença em humanos quanto em murinos, sugerem a existência de uma diferenciação, dependente da espécie, na capacidade de parasitos do gênero Leishmania causarem lesões no hospedeiro. A procura de fatores que diferenciam as espécies de Leishmania quanto à sua virulência se faz, então, necessária para o entendimento dos mecanismos pelos quais esses parasitos causam danos aos seus hospedeiros, possibilitando a descoberta de novas ferramentas de potencial terapêutico contra a leishmaniose. Componentes da via de metabolismo do ATP extracelular são candidatos potenciais para fatores de virulência desses parasitos, visto que tanto o ATP quanto a adenosina, produto da hidrólise de AMP, são capazes de influenciar a resposta imunológica do hospedeiro e, conseqüentemente, o estabelecimento do parasito. Essa hipótese é suportada pelo fato da Leishmania necessitar da utilização da via de salvação de purinas pela ação de enzimas, dentre elas as apirases, sobre o ATP extracelular, que possui propriedades imunoestimulantes, para gerar adenosina, produto da hidrólise do AMP pelas 5’-nucleotidases, cuja importância para o metabolismo do parasito e para a regulação da resposta imune está bem descrita na literatura. Para testar essa hipótese, nós estudamos três espécies de Leishmania com diferentes graus de virulência em camundongos C57BL/6: a mais virulenta L. amazonensis e as espécies L. braziliensis e L. major. Inicialmente, formas promastigotas metacíclicas e procíclicas desses parasitos foram testadas para sua capacidade de hidrolisar ATP, ADP ou AMP. As formas metacíclicas (infectantes) de L. amazonensis mostraram maior capacidade de hidrólise para os três nucleotídeos analisados, quando comparadas com as outras duas espécies menos virulentas. Além disso, sua capacidade de hidrólise de ATP foi maior que a das formas procíclicas da mesma espécie, sugerindo um controle de expressão de ATPases dependente de metaciclogênese. Posteriormente, foi verificado pelas técnicas de RTPCR, e “Western blotting” que, a despeito da ocorrência de expressão de mRNA para as isoformas solúvel e de membrana de apirases nas promastigotas metacíclicas das três espécies estudadas, somente extratos enriquecidos de membrana de L. amazonensis foram capazes de apresentar reação com anticorpo anti-apirase de T. cruzi. O inóculo de promastigotas metacíclicas desse parasito na presença de suramina, um inibidor de ecto ATPases, em camundongos C57BL/6, levou a uma diminuição no tamanho de lesão a partir da quarta semana de infecção e no parasitismo em 7 semanas de infecção. Por outro lado, a indução de maior atividade 5’-nucleotidásica dos parasitos ou a administração simultânea de adenosina ao inóculo levou a um aumento transiente no tamanho de lesão e a um maior parasitismo em 3 ou 4 semanas de infecção da mesma cepa de camundongos por promastigotas metacíclicas de L. braziliensis, resultado oposto ao obtido após o tratamento, no momento do inóculo, com o bloqueador de receptores A2B de adenosina, MRS 1754. Em conjunto, esses resultados sugerem que a redução dos níveis de ATP extracelular pela ação de enzimas expressas pelo parasito e/ou a elevação dos níveis de adenosina podem contribuir para o estabelecimento de parasitos do gênero Leishmania no hospedeiro vertebrado, indicando um possível alvo para futuras intervenções de caráter terapêutico contra as leishmanioses.
A inibição do proteassomo como alvo para a sensibilização de T. cruzi via processos redox.
(2018) Coelho, Aline Meireles; Garcia, Camila Carrião Machado; Garcia, Camila Carrião Machado; Tahara, Erich Birelli; Afonso, Luís Carlos Crocco
O Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado unicelular, causador da doença de Chagas. Durante seu ciclo de vida, o parasito consegue evadir sistemas de defesas, como macrófagos, tolerando altas doses de espécies reativas. Alguns dos sistemas de defesa do parasito passam pela alta capacidade de tolerar danos no DNA, ativação de vias de reparo muito eficientes e detoxificação de proteínas oxidadas pelo complexo ubiquitina-proteassomo. Dados recentes têm demonstrado que o não funcionamento do proteassomo é altamente tóxico induzindo morte significativa dos parasitos. Atualmente, alguns trabalhos têm relacionado a participação do proteassomo em mecanismos de reparo de DNA, o que se torna um alvo biotecnológico muito interessante. Com isso, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da inibição do proteassomo como um potencial alvo biotecnológico em T. cruzi frente a induções de danos no DNA e recrutamento de vias de reparo de DNA. Para isso, realizamos testes de toxicidade da cepa CL Brener na forma epimastigota com o proteassomo inibido em conjunto com diferentes dosagens de peróxido de hidrogênio, com a finalidade de induzir processos redox, e com o crotonaldeído, um aldeído formado como subproduto de lipoperoxidação, que causa alquilação nas bases nitrogenadas da fita de DNA e aminoácidos. De acordo com os resultados, o efeito da inibição do proteassomo induz maior morte celular em parasitos tratados com peróxido de hidrogênio. O que provavelmente está relacionado diretamente com uma possível participação do proteassomo em mecanismos de reciclagem de proteínas não funcionais, principalmente oxidadas ou para a processividade da vias de reparo de DNA.
Leishmania amazonensis induz a liberação de IL-1β ao interferir no sistema de sinalização de macrófagos.
(2019) Oshiro, Flávio Pignataro; Afonso, Luís Carlos Crocco; Afonso, Luís Carlos Crocco; Gomes, Thiago de Castro; Borges, William de Castro
O processo inflamatório, caracterizado pelo recrutamento celular e liberação de citocinas, compreende uma das respostas iniciais do sistema imunológico contra processos de infecção. No caso da infecção causada por parasitos do gênero Leishmania, o recrutamento inicial de células imunes não é capaz de evitar o estabelecimento da leishmaniose, em especial nos casos de infecção por Leishmania amazonensis. Um dos mecanismos utilizados pelo parasito para subverter o sistema imunológico compreende a interferência num sistema de sinalização celular conhecido como sinalização purinérgica, onde moléculas como o ATP extracelular influenciam o prosseguimento da resposta. De forma simplificada, o ATP atua sobre receptores específicos e inicia respostas de caráter pró-inflamatório. Para controlar seus efeitos, enzimas ancoradas à membrana degradam o ATP extracelular à adenosina, capaz de atuar de forma antagônica, resultando em respostas de caráter antiinflamatório. No presente trabalho, procuramos entender qual é o papel do parasito na indução de citocinas no contexto da sinalização purinérgica. Para isso, células mieloides de camundongos C57BL/6 foram diferenciadas, ativadas para a produção da citocina pró-infamatória IL-1β, e infectadas por parasitos da espécie L. amazonensis. O papel de proteínas envolvidas na sinalização purinérgica foi avaliado com o uso de fármacos específicos. Curiosamente, verificamos que L. amazonensis não só é capaz de induzir o aumento da liberação de IL-1β, como potencializa a liberação da citocina por meio da interferência no sistema de sinalização purinérgica de macrófagos. Desse modo, ao inibirmos a sinalização promovida pela adenosina, verificamos uma redução na liberação de IL-1β. Além disso, não ocorreram alterações no que diz respeito à produção dos marcadores pró-inflamatório, TNF e anti-inflamatório, IL-10. Nossos resultados sugerem o estabelecimento de um ambiente que promove o recrutamento de células do sistema imunológico – através da ação da IL-1β –, mas não a ativação dessas células, o que poderia auxiliar o parasito nos processos iniciais de infecção.

Browse

Browsing PROPP - Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-graduação by Author "Afonso, Luís Carlos Crocco"

Results Per Page

Sort Options